Plan de muestreo Flavobacterium psychrophilum en trucha 
Plan de muestreo Flavobacterium psychrophilum es la mejor opción para la vigilancia y control de una de las enfermedades más letales para trucha, hablamos de la Enfermedad Bacteriana de Agua Fría (BCWD por sus siglas en inglés). Es importante actuar de manera proactiva y analizar el crecimiento bacteriano es la clave para determinar en qué fase de crecimiento se encuentra las bacterias, para así tomar medidas preventivas eficaces.
En general, el aislamiento en cultivo y el antibiograma es un servicio habitual que realizamos informe se mostrará una fotografía del aislamiento en cajas de petri 90 mm de diámetro, recuento bacteriológico y una identificación presuntiva en base a la morfología de las UFC. Por ese motivo quisimos indagar en la situación actual de la flavobacteriosis.
El servicio básicamente consiste en la detección de bacterias con forma de bastón gram negativas largos y delgados (es recomendable realizar el servicio necropsia – diagnóstico histopatólogico previamente). A continuación, vendría el aislamiento en agar citofaga e incubación a 15°C con presencia de colonias amarillas pálidas que indican positivo para Flavobacterium psychrophilum, agente causante de la Enfermedad Bacteriana del agua fría BCWD.
Aunque no está mal de decir que ningún ejemplar llegó a perecer debido a BCWD durante los 3 meses que duró el plan de muestreo.
La propuesta de valor es realizar un programa de vigilancia y control para estar preparado en el caso que se pueda propagar un brote de flavobacteriosis. Además que causa una mortalidad del 50%, produce la degeneración del pedúnculo caudal, llegando en casos extremos a visualizarse la columna vertebral. La enfermedad bacteriana de agua fría BCWD se llama así porqué suele afectar en un rango de temperatura de 8 a 14°C, además los ejemplares juveniles de 2 – l0g (3 – 10 cm) son los más susceptibles, por eso motivo se escogió esa etapa. Esos ejemplares presentan mayor mortalidad y al proceder de ríos que oscilan en ese rango de temperatura. En cualquier momento se puede presentar desastre.
Entre las técnicas empleadas en el laboratorio, destacamos el uso de un kit de extracción ADN genómico que proporciona una técnica simple y conveniente para aislar ADN de alta calidad de bacterias Gram negativas como Flavobacterium psychrophilum utilizando un formato de columna de centrifugación rápida. El ADN del lisado celular se une selectivamente a la columna de centrifugación y otras impurezas como proteínas y sales no se unen a la columna y se eliminan en el flujo de salida. No se requiere extracción con fenol ni precipitaciones con etanol. El kit también es adecuado para el aislamiento de ADN genómico bacteriano de colonias en placas. El ADN genómico purificado puede tener hasta 50 kb de longitud.
El ADN purificado es adecuado para aplicaciones posteriores como digestiones con enzimas de restricción, PCR y otras aplicaciones.
En cuanto al aislamiento en cultivo agar citófaga para observación en vivo de Flavobacterium psychrophilum, primero se realiza la recolección de órganos de trucha, incluyendo el riñón anterior, el bazo, el hígado y la piel. La siembra masiva se realiza utilizando un hisopo y el cultivo se incuba a temperaturas entre 10°C y 20°C durante 96 horas. Las colonias resultantes son de color amarillo pálido, convexo y tienen un diámetro de 2-3 mm, pareciéndose a huevos fritos. En todo momento se dispuso de la incubadora para mantener la temperatura requerida. También se procedió a observar con Infinity Analyzer 2 a través del objetivo triocular del AXIO SCOPE A1, viendo cómodamente desde la pantalla del computador.
Otra técnica que se realizó fue el aislamiento en cultivo agar citófaga para observación por tinción Gram. Primero era hacer un corte de 5 x 5 x 5 mm en el bazo de la trucha y fijar una parte en NBF o etanol al 95%. El segundo procedimiento era realizar una tinción de Gram, que implica agregar violeta de cristal a la preparación, lavarla con agua, agregar la solución de Lugol, lavarla nuevamente, agregar alcohol-acetona, agregar safranina y lavarla una vez más. Finalmente, la preparación debe dejarse secar y observarse bajo un microscopio utilizando el objetivo 100X.
Por último, realizamos el antibiograma, primero utilizar el hisopo, retirarlo por el mango para evitar contaminación cruzada, sumergirlo en el tubo de ensayo o tomar una colonia con ligera presión, es bueno marcar con sharpie negro un punto en la visual del operario a 1 centímetro del algodón para mayor precisión. Rotular con las iniciales y fecha. Poner líneas divisorias con la regla. A continuación, realizar una primera siembra masiva por toda la superficie del agar y colocar la caja en perpendicular para hacer una segunda. Después colocamos los 3 sensidiscos C – FFC – OT equidistantes, realizando una ligera presión para que quedé fijado, si se cae del lugar se descarta. Por último, dejar la placa invertida en la incubadora a 18 grados durante 92 – 96 horas.
En el plan de muestreo se procesaron un total de 98 truchas durante 13 semanas procedentes de Pescados Frescos de Colombias S.A.S., con sede en Pereira. Es importante remarcar que el número de truchas procesadas fue mayor a las previstas que eran 70, eso respondió a temas logísticos que dificultaron la llegada de los sensidiscos para llevar a cabo el antibiograma, en lugar de eso, lo que es aislamiento en cultivo en medio citófaga en las semanas que estaban previamente programadas para los antibiogramas. A modo informativo, a partir de ahora designamos muestra como juvenil de trucha “dedino” de 2 – 10 gramos (3 – 10 cm), aunque también se
procesaron alevinos y juveniles de hasta 38,27 gramos, el plan de muestreo fue desglosado de la siguiente forma:
- 7 muestras para aislamiento en cultivo por extracción de ADN genómico de la bacteria Flavobacterium psychrophilum. El aislamiento se realizará en medio Cytophaga, esta se incubará a 10°C en una incubadora refrigerada entre 48 – 72 horas, dependiendo de la semana.
Obviamente se tendrá en cuenta todo lo relacionado con Bioseguridad. - 42 muestras se realizarían a partir de frotis fijado con solución Diff-quik que permite visualizar la presencia de las bacterias con forma de bastones gram negativos finos y delgados.
- 42 muestras se haría en fresco para observar los movimientos de deslizamiento, en
la última con el lote 21 se aisló la cepa bacteriana de Flavobacterium psychrophilum directamente de las colonias “UFC”. - 7 muestras analizadas en el antibiograma: 1 muestra control positivo Escherichia coli ATCC 25922, 4 muestras con Cloramfenicol “C” con concentraciones de 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL y 4 μg/mL, 1 muestra con Oxitetraciclina “OT” 30 μg y por último una muestra con Florfenicol “FFC” 30 μg.
En base a ciertas investigaciones en los cambios de alimentación a un concentrado de baja calidad o incluso al variar el porcentaje de proteína hay una mayor susceptibilidad a Flavobacterium psychrophilum
Las variables ambientales son claves, de ahí que Flavobacterium psychrophilum, sea el agente causante de la enfermedad bacteriana de agua fría. Se llama así porqué suele afectar en un rango de temperatura de 8 a 14°C, los ejemplares juveniles de 2 – 10 g (3 – 10 cm) son los más susceptibles. En estos casos, la mortalidad puede alcanzar el 50%.
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