Estandarización del método de aislamiento en nitrosomonas y nitrobacter a partir de agua en piscícola

1. Ana María Chica Londoño: Microbióloga en el área de biotecnología en Tecnoparque Pereira (Colombia).
2. Diego Fernando combita: Gestor del área de biotecnología. 

Ciertamente todas las formas de vida dependen del nitrógeno, este es el componente esencial de proteínas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas fundamentales del metabolismo, la mayoría de los ecosistemas contienen cantidades escasas de N. El nitrógeno es soluble en agua y circula a través del aire, el agua y los tejidos vivos (en estado reducido).

Por lo tanto, son pocos los organismos capaces de asimilarlo, entre ellos las Nitrosomonas y Nitrobacter, las cuales podemos encontrar en el agua de los lagos, también denominados circuito cerrado de explotación piscícola, donde los peces liberan gran cantidad de amoníaco en sus excrementos, cantidad que de no ser degradada por estas bacterias sería tóxico para los mismos peces, la proliferación natural de estas bacterias no es suficiente para degradar todo el amoniaco y hacerlo recircular en el ciclo biológico del nitrógeno, por esto se utilizan filtros  como el que se busca obtener en este trabajo de investigación y recubrirlo con las bacterias mencionadas para ayudar al circuito cerrado, este trabajo cuenta con dos objetivos: el primero es el aislamiento y purificación de cepas de Nitrosomonas spp y Nitrobacter spp, en segundo lugar, la fabricación de un material de soporte derivado de la madera de guadua.

1. Aislar y purificar cepas de Nitrosomonas spp y Nitrobacter spp.
2. Fabricar un material de soporte derivado de la madera de guadua, que sirva para la implementación de un filtro biológico, el cual se pretende usar como andamio para el crecimiento de las nitrosomonas y nitrobacter.

Ciertamente el nitrógeno es un elemento increíblemente versátil que existe en forma inorgánica y orgánica, y a la vez en muchos y diferentes estados de oxidación. Todas las formas de vida dependen del nitrógeno. Es el componente esencial de proteínas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas fundamentales del metabolismo, la mayoría de los ecosistemas contienen cantidades escasas de N. El nitrógeno es soluble en agua y circula a través del aire, el agua y los tejidos vivos (en estado reducido), Son pocos los organismos capaces de asimilarlo, entre ellos los procariotas como las cianobacterias y las azotobacterias, los organismos foto autótrofos (plantas o algas) requieren por lo general de nitrato (NO3 -) como forma de ingresar su nitrógeno; los heterótrofos (p.ej. los animales) necesitan el nitrógeno ya reducido, en forma de radical amino, que es como principalmente se presenta en la materia viva.

Asimismo el ciclo biogeoquímico del nitrógeno (N) es un sistema dinámico que sucede a través de la biosfera por medio de procesos que son mediados principalmente por microorganismos presentes en el suelo. Este circula y recircula a través del mundo y se compone de tres etapas principales:

• 1- Amonificación: La Amonificación es la conversión del nitrógeno que en la materia viva aparece principalmente como grupos amino (-NH2) o imino (-NH-) a ión amonio.
• 2- Nitrificación: es el proceso por el cual varias especies de bacterias comunes en los suelos son capaces de oxidar el amoníaco o el ion amonio. Es un proceso generador de energía.
• 3- Asimilación: es la parte del proceso donde los autótrofos reducen el nitrógeno oxidado que reciben como nitrato (NO3-) a grupos amino, reducidos.

Anteriormente como se mencionó en párrafos anteriores los microrganismos son parte fundamental del ciclo del nitrógeno, especialmente las nitrosomonas y nitrobacter de las cuales hay muy poca información investigativa publica acerca de su aislamiento y cultivo en laboratorio, además de su caracterización morfológica.

Hasta el momento se sabe que estas bacterias realizan la nitrificación utilizando dos formas de nitrógeno reducido, amoniaco y nitritos, como fuente de energía para su metabolismo, obteniéndose al final el nitrito, que es utilizado como fuente de nitrógeno por otros organismos. Por tanto, podemos distinguir dos tipos de nitrificantes: los que convierten amoniaco, o sales amoniacales a nitritos (nitrosomonas) y los que convierten este nitrito en nitrato (nitrobacter), recibiendo a veces los nombres de gérmenes nitrosos y nítricos, respectivamente.^3,4

Por lo tanto, estos microorganismos no se encuentran únicamente en la tierra, sino también en el agua de los lagos, también denominados circuito cerrado de explotación piscícola, donde el agua antes de introducir los peces es prácticamente estéril y el ciclo tarda en madurar unas 8 o 12 semanas dependiendo del tamaño y de la carga biológica que tenga (filtros, plantas, etc.), durante este tiempo no se deben colocar peces en el lago ya que el ciclo del nitrógeno aún no ha madurado y se corre el riesgo de que estos mueran por intoxicación de los elementos nitrogenados mencionados anteriormente ya que las bacterias que llegan al estanque generalmente en estado natatorio, es decir a través del agua, las plantas, la tierra, etc.aún no han pasado a formar colonias y a oxidar el amoníaco y convertirlo en nitritos (NO2),en ese tiempo de maduración, el estanque pasará por diversos estados, desde agua cristalina, pasando a agua verde y llegando a agua cristalina nuevamente, si es que todo se realizó de manera correcta.

En consecuencia, al ingresar los peces al estanque estos empiezan a emitir amoniaco (NH3) que es bastante tóxico cuando está en exceso, sobre todo cuando hay niveles de pH altos, mayores que 8, cuando esto sucede el pez mostrará síntomas como jadeo, rayas rojas en sus aletas y cuerpo, se caerá hacia el sustrato, después de que las nitrosomonas toman el amoniaco producto del desecho de los peces lo convierten en nitritos (NO2) los cuales son convertidos por las nitrobacter en nitratos (NO3) y aunque en esta parte del proceso una gran cantidad de este no es toxico para los peces, en niveles elevados puede llegar a molestarlos, por  eso, es conveniente colocar muchas plantas acuáticas, flotantes, etc. No es solo una decoración las plantas en los estanques, es una etapa del ciclo biológico. En estanques donde no hay muchas plantas porque no se quiere colocarlas o por no ser del estilo, cobra muchísima más importancia los sistemas de filtración.

Por lo mencionado anteriormente se utilizan filtros biológicos que son un sistema de filtrado natural en el que existen colonias bacterianas de especies específicas que van captando suciedad y contaminantes del agua y los transforman en sustancias no nocivas. Los filtros biológicos están destinados principalmente a eliminar compuestos nitrogenados mediante su transformación en nitratos (sales de nitrógeno) y restos de materia orgánica que es transformada a CO2 y agua.⁸

Por otro lado, las nitrosomonas y las nitrobacterias crecerán formando colonias bacterianas en los filtros, y también estarán dispersas en la propia agua. La mayor concentración se encuentra en los filtros que están diseñados para maximizar el crecimiento de estas bacterias y permiten el desarrollo microbiano de estas bacterias nitrificantes en su superficie, aunque no es selectivo y muchas otras bacterias no deseadas aprovechan para multiplicarse en él, es por esta razón que en este estudio se realizó el filtro y el aislamiento y purificación de las bacterias en laboratorio, para acelerar la maduración del filtro biológico.^9,10

En conclusión, existen cinco fases diferenciadas en la vida de un filtro biológico: ausencia de nitrificación (alta concentración de amonio), activación (alta concentración de nitritos), madurez, sensibilidad e inactivación. La fase de madurez es la ideal para la buena marcha del sistema. Un filtro biológico se considerar maduro cuando las poblaciones microbianas oxiden rápidamente todos los aportes de amonio a nitratos, sin apenas aparición de los nitritos intermedios.¹¹

En primer lugar tenemos el filtro biológico de guadua. Para esta parte del proceso se siguió un procedimiento ya descrito por (Zhu, M., Song, J; et al.,2016) denominado Highly Anisotropic, Highly Transparent Wood Composites donde el proceso se dividió en 2 partes, para el primer proceso se preparó una solución que contenía NaOH Y Na₂SO₃ en las concentraciones mencionadas en el artículo de referencia, después de tener la mezcla de estas soluciones se procedió a cortar cuadritos de guadua de 2cm de ancho x 4cm de largo, para continuar con el reflujo, el cual se realizó con un destilador conectado a una fuente agua como refrigerante, esto se dejó a reflujo y temperatura constante durante 12 horas.

En el segundo proceso, después de pasar las 12 horas, se volvió a poner en reflujo 3 veces solo con agua destilada para eliminar los residuos de la lignina durante 1 hora, seguidamente se agregó una solución de H₂O₂ 2.5M la cual se preparó pesando 0.811g y adicionándolos en un frasco con 500 ml de agua destilada, esta se dejó en reflujo a temperatura constante durante 12 horas para blanquear completamente la esponja. 

Durante este proceso se obtuvo como resultado una esponja poroso con un color claro,tal y como se esperaba para poder utilizarla como un filtro.

Hasta el momento las bacterias han mostrado crecimiento promisorio, por lo que se deduce que ambas cepas están presentes en el medio de cultivo ya que ambas se necesitan entre sí para poder evidenciar ese crecimiento, debido al largo tiempo que se demora en crecer, se debe esperar para aislar cada una de las colonias por separado brindándole las condiciones necesarias para cada una individualmente.